Uma célula animal típica tem 10-20 μm de diâmetro, que é cerca de um quinto do tamanho da menor partícula visível a olho nu. Não foi até que bons microscópios de luz ficassem disponíveis no início do século XIX que todos os tecidos vegetais e animais foram descobertos como agregados de células individuais. Essa descoberta, proposta como doutrina celular por Schleiden e Schwann em 1838, marca o nascimento formal da biologia celular.
As células animais não são apenas pequenas, também são incoloras e translúcidas. Conseqüentemente, a descoberta de suas principais características internas dependia do desenvolvimento , na última parte do século XIX, de uma variedade de manchas que proporcionavam um contraste suficiente para tornar visíveis esses recursos. Da mesma forma, a introdução do microscópio eletrônico muito mais poderoso no início da década de 1940 exigiu o desenvolvimento de novas técnicas para preservar e colorir células antes que as complexidades completas de sua estrutura fina interna pudessem começar a surgir. Até hoje, a microscopia depende tanto das técnicas de preparação do espécime quanto da performance do próprio microscópio. Nas discussões que se seguem, consideramos os instrumentos e a preparação dos espécimes, começando pelo microscópio de luz.
O microscópio de luz pode resolver detalhes 0,2 μm de lado
Em geral, um dado tipo de radiação não pode ser usado para sondar detalhes estruturais muito menores do que o seu próprio comprimento de onda. Esta é uma limitação fundamental de todos os microscópios. O limite máximo para a resolução de um microscópio de luz é, portanto, definido pelo comprimento de onda da luz visível, que varia de cerca de 0,4 μm (para violeta) a 0,7 μm (para vermelho escuro). Em termos práticos, bactérias e mitocôndrias, com cerca de 500 nm (0,5 μm) de largura, são geralmente os objetos mais pequenos cuja forma pode ser claramente discernida no microscópio de luz ; detalhes menores do que isso são obscurecidos por efeitos resultantes da natureza ondulada da luz. Para entender por que isso ocorre, devemos seguir o que acontece com um feixe de ondas de luz à medida que passa pelas lentes de um microscópio.
Devido à sua natureza ondulante, a luz não segue exatamente os caminhos de raios diretos idealizados previstos pela ótica geométrica. Em vez disso, as ondas de luz viajam através de um sistema óptico por uma variedade de rotas ligeiramente diferentes, de modo que interferem entre si e causam efeitos de difração óptica . Se dois trens de ondas atingirem o mesmo ponto por caminhos diferentes são precisamente em fase , com crista de correspondência de crista e calha de correspondência, eles se reforçarão para aumentar o brilho. Em contraste, se os trens de ondas estiverem fora de fase , eles interferirão uns com os outros de modo a se cancelarem parcialmente ou parcialmente. A interação da luz com um objeto altera as relações de fase das ondas de luz de uma maneira que produz efeitos de interferência complexos . Em grande ampliação, por exemplo, a sombra de uma borda reta que é uniformemente iluminada com luz de comprimento de onda uniforme aparece como um conjunto de linhas paralelas, enquanto a de um ponto circular aparece como um conjunto de anéis concêntricos. Pela mesma razão, um único ponto visto através de um microscópio aparece como um disco borrado e dois objetos de ponto juntos entregam imagens sobrepostas e podem se fundir em um. Nenhuma quantidade de refinamento das lentes pode superar essa limitação imposta pela natureza ondulada da luz.
A separação limitante em que dois objetos ainda podem ser vistos como distintos – o chamado limite de resolução –depende tanto do comprimento de onda da luz quanto da abertura numérica do sistema de lente usado. Esta última quantidade é uma medida da largura da pupila de entrada do microscópio, dimensionada de acordo com sua distância do objeto; quanto mais amplo o microscópio abre o olho, por assim dizer, mais forte pode ver. Nas melhores condições, com luz violeta (comprimento de onda = 0,4 μm) e uma abertura numérica de 1,4, um limite de resolução de pouco menos de 0,2 μm pode teoricamente ser obtido no microscópio de luz. Esta resolução foi alcançada por fabricantes de microscópios no final do século XIX e raramente é combinada em microscópios contemporâneos produzidos em fábrica. Embora seja possível ampliar uma imagem tanto quanto se deseja – por exemplo, projetando-a em uma tela – nunca é possível resolver dois objetos no microscópio de luz que são separados por menos de cerca de 0,2 μm; eles aparecerão como um único objeto.
Vemos em seguida como interferência e difração podem ser exploradas para estudar células não coradas no estado vivo. Mais tarde, discutimos a forma como as preparações permanentes das células são feitas para visualização no microscópio de luz e como manchas químicas são usadas para aumentar a visibilidade das estruturas celulares em tais preparações.
As células vivas são vistas claramente em um contraste de fase ou um microscópio de contraste de interferência diferencial
A possibilidade de que alguns componentes da célula possam ser perdidos ou distorcidos durante a preparação da amostra sempre desafiou os microscopistas. A única maneira certa de evitar o problema é examinar as células enquanto elas estão vivas, sem fixação ou congelamento. Para este fim, os microscópios de luz com sistemas ópticos especiais são especialmente úteis.
Quando a luz passa através de uma célula viva, a fase da onda de luz é alterada de acordo com o índice de refração da célula: a luz que passa através de uma parte relativamente espessa ou densa da célula, como o núcleo , é retardada; sua fase, conseqüentemente, é deslocada em relação à luz que passou por uma região mais fina adjacente do citoplasma . O microscópio de contraste de fase e, de forma mais complexa , o microscópio de contraste de interferência diferencial , exploram os efeitos de interferência produzidos quando esses dois conjuntos de ondas se recombinam, criando assim uma imagem da estrutura da célula ( Figura 9-7 ). Ambos os tipos de microscopia óptica são amplamente utilizados para visualizar células vivas.
Uma maneira mais simples de ver algumas das características de uma célula viva é observar a luz espalhada por seus vários componentes. No microscópio de campo escuro , os raios iluminantes da luz são direcionados do lado, de modo que somente a luz dispersa entre nas lentes do microscópio. Consequentemente, a célula aparece como um objeto brilhante contra um fundo escuro. Com um microscópio de campo brilhante normal , a imagem é obtida pela simples transmissão de luz através de uma célula em cultura. As imagens da mesma célula obtidas por quatro tipos de microscopia de luz são mostradas na Figura 9-8 .
